【文獻(xiàn)分享】一種可“DIY”的四聚體——Flex-TTM在腫瘤新抗原研究中的應(yīng)用

前言

T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答是由抗原遞呈細(xì)胞和T細(xì)胞之間通過主要組織相容性復(fù)合物（MHC）和T細(xì)胞受體（TCR）的相互作用決定的，因此鑒定和分析抗原特異性T細(xì)胞在疫苗療效監(jiān)控，癌癥研究、病毒感染、抗原分析等研究種至關(guān)重要。四聚體技術(shù)可在單細(xì)胞水平上標(biāo)記抗原特異性T細(xì)胞并通過流式細(xì)胞術(shù)檢測。四聚體通常由4個MHC單體分子和1個鏈霉親和素組成，是一種快速、方便的抗原特異性T細(xì)胞檢測技術(shù)。 

下面我們跟大家分享一篇運用Flex-T^TM “DIY”的四聚體（Flexible-Tetramers）進(jìn)行腫瘤治療相關(guān)研究的文獻(xiàn)，作者使用Flex-T^TM UV-labile Momomer UVX（Biolegend，Cat#280004）制備針對Neo-T特異性抗原的四聚體進(jìn)行抗原特異性T細(xì)胞檢測分析。

研究背景

過繼性T細(xì)胞療法（ACT）正成為癌癥患者強(qiáng)有力的治療選擇，包括嵌合抗原受體（CAR） T細(xì)胞、T細(xì)胞受體（TCR）T細(xì)胞和腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞（TILs）的過繼轉(zhuǎn)移。其中，有研究證實了TILs的過繼轉(zhuǎn)移可以介導(dǎo)幾種實體瘤的持久消退，然而，然而，收集TILs需要對腫瘤組織進(jìn)行侵入性采樣，并且往往受到切除腫瘤組織相對較小的限制，并且一些腫瘤部位也不容易接近。最近，一些研究報道在癌癥患者的外周血中發(fā)現(xiàn)了識別新抗原的T細(xì)胞克隆。外周血淋巴細(xì)胞（PBLs）中的T細(xì)胞能識別與TILs相同的P53新抗原。因此，PBL可能是開發(fā)新抗原靶向ACT治療癌癥患者的可靠且無創(chuàng)的T細(xì)胞來源。

通常在ACT之前需要進(jìn)行非清髓性淋巴細(xì)胞耗竭（氟達(dá)拉濱和環(huán)磷酰胺是淋巴細(xì)胞耗竭化療中最常用的藥物），目的是抑制宿主免疫系統(tǒng)，以降低免疫原性，增加IL-2、IL-7、IL-15等的可用性，減少調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，增加輸注T細(xì)胞的持久性。然而，淋巴細(xì)胞減少也會導(dǎo)致神經(jīng)毒性、中性粒細(xì)胞減少癥、貧血和更大的感染風(fēng)險。淋巴細(xì)胞耗竭的劑量強(qiáng)度在不同的中心和臨床試驗中差異很大，并且似乎是T細(xì)胞產(chǎn)物特異性的。那么，四聚體檢測技術(shù)在本研究中扮演著何種角色呢？

研究內(nèi)容

針對這些問題，中山大學(xué)徐瑞華團(tuán)隊在2023年6月10日發(fā)表了題為“A pilot study of lymphodepletion intensity for peripheral blood mononuclear cell-derived neoantigen-specific CD8⁺ T cell therapy in patients with advanced solid tumors”的研究論文。該研究開發(fā)了一種從癌癥患者的外周血單個核細(xì)胞（PBMCs）中產(chǎn)生個性化Neo-T（新抗原特異性CD8⁺ T細(xì)胞）的方法。作者建立了一個流程，包括通過生物信息學(xué)分析預(yù)測新抗原，并在25天內(nèi)大規(guī)模擴(kuò)增新抗原特異性T細(xì)胞。為了評估Neo-T治療的臨床療效并確定Neo-T治療的最佳淋巴細(xì)胞耗竭強(qiáng)度，作者進(jìn)行了一項首次在人體中使用氟達(dá)拉濱和環(huán)磷酰胺增加劑量的Neo-T治療的研究。該研究是一項開放標(biāo)簽I期臨床試驗（NCT02959905），包括標(biāo)準(zhǔn)治療難治的局部晚期或轉(zhuǎn)移性實體瘤患者。

圖. 新抗原預(yù)測和Neo-T制造流程示意圖

圖. Neo-T療法臨床試驗圖

A：臨床試驗流程圖；B：臨床試驗方案

此外，為了確認(rèn)每個患者產(chǎn)生的Neo-T能夠識別預(yù)測的新抗原，作者通過四聚體檢測技術(shù)檢測了Neo-T中的CD8⁺ T細(xì)胞以及新抗原特異性細(xì)胞。根據(jù)四聚體染色結(jié)果，所有Neo-T產(chǎn)物的細(xì)胞存活率和CD8⁺ T細(xì)胞百分比均大于90%，Neo-T中新抗原特異性T細(xì)胞在0.5%至45%之間。四聚體檢測大致流程如下：

四聚體檢測Neo-T細(xì)胞實驗流程

1、收集細(xì)胞，洗滌，在FACS緩沖液中重懸；

2、通過紫外線輻射介導(dǎo)的肽交換法生成肽- MHC單體，再與熒光標(biāo)記的鏈霉親和素合成四聚體；

3、使用小鼠抗人CD3、CD8和Flex-T? 四聚體，在4°C下染色15分鐘；

4、在FACS緩沖液中洗滌兩次；

5、使用流式細(xì)胞儀對細(xì)胞進(jìn)行分析，基于DAPI對活細(xì)胞圈門，并對“CD8⁺ pMHC -四聚體⁺細(xì)胞”進(jìn)行分類；

6、使用流式數(shù)據(jù)處理軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

（Flex-T^TM四聚體制備和流式染色詳細(xì)Protocol可前往Biolegend官網(wǎng)查詢：https://www.biolegend.com/en-us/protocols/flex-t-tetramer-preparation-and-flow-cytometry-staining-protocol）

圖：Neo-Ts細(xì)胞流式分析圈門策略

研究結(jié)果

研究結(jié)果表明，在Neo-T治療期間，從無淋巴細(xì)胞耗竭到高劑量治療，不同的淋巴細(xì)胞耗竭劑量耐受性良好。Neo-T療法在晚期實體瘤患者中顯示出良好的臨床療效，ORR（客觀緩解率）為33.3%（3/9），DCR（疾病控制率）為66.7%（6/9）。與高強(qiáng)度組相比，無淋巴細(xì)胞耗竭組在Neo-T治療期間出現(xiàn)PR（部分緩解）的患者更多。在兩名有反應(yīng)的患者中檢查新抗原特異性TCR，并在淋巴細(xì)胞耗竭治療后顯示延遲擴(kuò)張。

綜上，該研究揭示，沒有淋巴細(xì)胞耗竭的Neo-T療法可能是晚期實體瘤的安全且有前途的治療策略。

Flex-T^TM UV-labile Momomer——抗原特異性T細(xì)胞分析的理想工具

Flex-T^TM UV-labile Momomer，一款Biolegend推出的抗原特異性T細(xì)胞檢測工具，是一種預(yù)載了UV敏感多肽的生物素化MHC單體。在經(jīng)過UV照射后，Flex-T^TM UV-labile Momomer的多肽結(jié)合位點暴露，感興趣的目標(biāo)肽加載，產(chǎn)生具有足夠親和力的“DIY” MHC Monomer，肽交換效率可使用ELISA進(jìn)行檢測，“DIY” MHC Monomer與Streptavidin 組裝成不同的Tetramer。這種靈活的處理方式實現(xiàn)了感興趣多肽或者抗原特異性T細(xì)胞的高通量篩選。如今，這一款抗原特異性T細(xì)胞分析工具已被運用在多個研究方向中，例如腫瘤、感染性疾病（COVID-19、HBV等）、疫苗研發(fā)等。

本研究中使用的Flex-T?產(chǎn)品

參考文獻(xiàn)：

Li, D., Chen, C., Li, J., Yue, J., Ding, Y., Wang, H., Liang, Z., Zhang, L., Qiu, S., Liu, G., Gao, Y., Huang, Y., Li, D., Zhang, R., Liu, W., Wen, X., Li, B., Zhang, X., Zhang, X., & Xu, R. H. (2023). A pilot study of lymphodepletion intensity for peripheral blood mononuclear cell-derived neoantigen-specific CD8?+?T cell therapy in patients with advanced solid tumors. Nature communications, 14(1), 3447. https://doi.org/10.1038/s41467-023-39225-7

Supplementary Information：

https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/instance/10257664/bin/41467_2023_39225_MOESM1_ESM.pdf